叶面喷施水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因表达的影响

杨慧芹, 余万都, 张丽颖, 高冬丽, 尚轶, 马玲

杨慧芹, 余万都, 张丽颖, 等. 叶面喷施水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因表达的影响[J]. 西南林业大学学报(自然科学), 2021, 41(5): 184–188 . DOI: 10.11929/j.swfu.202005057
引用本文: 杨慧芹, 余万都, 张丽颖, 等. 叶面喷施水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因表达的影响[J]. 西南林业大学学报(自然科学), 2021, 41(5): 184–188 . DOI: 10.11929/j.swfu.202005057
Yang Huiqin, Yu Wandu, Zhang Liying, Gao Dongli, Shang Yi, Ma Ling. Effects of Foliar Spraying Salicylic Acid on the Content of Chlorogenic Acid and Expression of Key Enzyme Gene in Solanum tuberosum Leaves[J]. Journal of Southwest Forestry University, 2021, 41(5): 184-188. DOI: 10.11929/j.swfu.202005057
Citation: Yang Huiqin, Yu Wandu, Zhang Liying, Gao Dongli, Shang Yi, Ma Ling. Effects of Foliar Spraying Salicylic Acid on the Content of Chlorogenic Acid and Expression of Key Enzyme Gene in Solanum tuberosum Leaves[J]. Journal of Southwest Forestry University, 2021, 41(5): 184-188. DOI: 10.11929/j.swfu.202005057

叶面喷施水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因表达的影响

基金项目: 国家自然科学基金面上项目(31972433)资助;云南师范大学博士研究生创新基金项目(yjs2018151)资助
详细信息
    作者简介:

    杨慧芹(1988—),女,博士研究生。研究方向:马铃薯营养与品质研究。Email: yanghuiqin1012@163.com

    通讯作者:

    马玲(1987—)女,助理研究员。研究方向:马铃薯分子生物学研究。Email: maling223322@126.com

  • 中图分类号: S532.0

Effects of Foliar Spraying Salicylic Acid on the Content of Chlorogenic Acid and Expression of Key Enzyme Gene in Solanum tuberosum Leaves

  • 摘要: 以二倍体马铃薯CIP−65为试验材料,用0.01、0.10、1.00 mmol/L 3种不同浓度的SA溶液对马铃薯叶片进行喷施处理,然后采用紫外分光光度法和qRT−PCR法对CGA含量和CGA合成关键酶—羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶HQT基因的表达水平进行检测,分析水杨酸(SA)对马铃薯叶片中绿原酸(CGA)含量及关键酶基因表达的影响。结果表明:低浓度SA(0.01 mmol/L)处理后,马铃薯叶片中的CGA含量明显提高,HQT基因的表达也被激活,与绿原酸变化趋势一致;中等浓度(0.1 mmol/L)的SA处理也明显提高了马铃薯叶片中的HQT表达量和CGA含量,但CGA含量的增幅低于0.01 mmol/L的SA处理;高浓度(0.1 mmol/L)的SA处理在一定程度上促进了HQT基因的表达,但绿原酸的含量与处理前相比差异不大。因此,较低浓度的SA喷施处理能够促进马铃薯叶片中HQT基因的表达和CGA的积累。
    Abstract: The diploid Solanum tuberosum CIP−65 was used as the test material in this study, and the S. tuberosum leaves were sprayed with 3 different concentrations of salicylic acid(SA) solutions of 0.01, 0.10, and 1.00 mmol/L. Then, the content of chlorogenic acid(CGA) and the expression level of hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase(HQT) gene were detected by UV spectrophotometry and qRT-PCR. The effects of SA on CGA content and the expression of key enzyme gene in S. tuberosum leaves were analyzed. The results showed that the content of CGA and the expression of HQT gene in S. tuberosum leaves were significantly increased after low concentration of SA(0.01 mmol/L), and the expression of HQT gene was also activated, which was consistent with the change trend of CGA; the expression of HQT and CGA content in S. tuberosum leaves were significantly increased by SA treatment with medium concentration(0.1 mmol/L), but the increase of CGA content was lower than that of 0.01 mmol/L SA treatment; high concentration(0.1 mmol/L) of SA solution promoted the expression of HQT gene, but the content of CGA was not significantly different from that before treatment. In conclusion, SA treatment with lower concentration could promote the expression of HQT gene and the accumulation of CGA in S. tuberosum leaves.
  • 马铃薯(Solanum tuberosum),为茄科茄属1年生草本植物,又称土豆、地蛋、洋芋等[1]。马铃薯种植可追溯到公元前8000~5000年的秘鲁南部。其形态特征为草本,茎分地上茎和地下茎两部分,可食用部分为地下茎。地下茎呈块状,扁球形或长圆形,直径3~10 cm,外皮呈白色、浅红色或紫色。马铃薯是全球第四大粮食作物,仅次于玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)和小麦(Triticum aestivum),已成为世界性重要的口粮来源和多种工业加工原料[2]。马铃薯在云南省的种植更为普遍,现已成为云南省第三大农作物,并成为促进云南贫困地区经济发展的主要产业。马铃薯因其含较多的淀粉、蛋白质、无机盐等,深受广大人民群众的喜爱[3]。除了食用价值之外,马铃薯还具有调中、健脾益气、消炎解毒等广泛的药用价值,所含酚酸、黄酮等酚类物质具有多种保健作用[4]

    酚类化合物是植物中分布最广泛的次生代谢产物,在植物生长发育和逆境信号转导中起着重要作用。马铃薯中最主要的酚类物质是绿原酸(CGA),它是一种天然的抗氧化剂,其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、J基羟基茵香醚和生育酚[5],在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。绿原酸,化学名称为3−O−咖啡酰奎尼酸,分子式为C6H18O9。绿原酸具有广泛的生物活性,研究表明绿原酸对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药用功能,现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、医药、保健和日用化工等领域[6]。此外,绿原酸等酚类物质在植物抗病中也具有重要作用[7]。在体外实验中,绿原酸具有广泛的抗真菌活性,能完全抑制孢子萌发或菌丝长度从而起到杀菌剂的作用。有研究表明,绿原酸能有效抑制马铃薯疮痂病、黑胫病和晚疫病等病原菌的侵染[8]。通过HQT合成绿原酸的途径是其主要的合成途径[9-10],目前对这一途径中HQT基因功能的研究较为深入,越来越多的实验证明了它与绿原酸合成的直接关系。大量研究结果表明,在富含绿原酸的植物,如番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)、朝鲜蓟(Cynara scolymus)、咖啡(Coffea arabica)和金银花(Lonicera japonica )中都存在HQT基因,并且HQT在体内体外都可以直接催化咖啡酰辅酶A与奎宁酸生成绿原酸[6]。研究表明,过表达HQT基因能明显提高植物体内的绿原酸含量[11-12];相反,沉默HQT基因后绿原酸含量显著下降[13]

    水杨酸(SA)作为一种信号分子,在植物的抗病过程中发挥着重要作用,它能诱导植物系统获得性抗性,激活植物抗性反应,诱导某些抗性基因及抗性相关蛋白的表达,从而诱导植物对细菌、真菌和病毒等产生系统抗性[14]。鉴于绿原酸在植物抗病性方面具有重要作用,本研究以水杨酸作为诱导剂,对二倍体马铃薯叶片进行叶面喷施,研究了水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因HQT表达的影响,为绿原酸在植物抗病方面的研究提供一定的参考。

    本试验选用的材料为国际马铃薯中心(CIP)提供的二倍体马铃薯CIP−65。取苗龄为3周的CIP−65无菌苗,选择状态良好,长势一致的移栽到直径25 cm的花盆中,置于温室内正常生长。

    马铃薯苗移栽30 d后,分别用0.01、0.1、1 mmol/L的SA进行叶面喷施,在处理后不同时间段(6、12、24 h)分别进行叶片样品采集(选取植株顶端完全展开、状态良好、无任何病变的功能叶),液氮速冻后,−80 ℃保存备用。以0 h未经任何处理的叶片样品作为对照。

    参照钟方晓[15]的方法稍作修改:准确称取0.2 g马铃薯叶片样品,加入2 mL 75%乙醇研磨匀浆,超声波在4 ℃条件下震荡萃取30 min,萃取结束后,4 ℃,12000 r/min离心2 min,取上清适当稀释后于327 nm波长下检测吸光度,以75%乙醇为空白对照。根据标准曲线计算绿原酸含量。

    标准曲线制作:以75%乙醇为溶剂,先配制成100 mL含绿原酸20 mg的溶液,再依次配制成100 mL中含绿原酸0.5、1.0、1.5、2.0 mg 4种不同浓度的绿原酸准溶液。取2 mL绿原酸标准溶液于327 nm处测出各标准溶液的吸光值,以2 mL 75%乙醇代替绿原酸标准溶液作为空白。以系列标准绿原酸浓度为横坐标,对应的吸光值为纵坐标。

    用天根公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒来提取马铃薯叶片样品中的总RNA。提取的RNA用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计进行检测,A260/A280值在1.8~2.1之间。按照TaKaRa公司的反转录试剂盒(Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)进行反转录反应,并将反转录得到的cDNA作为荧光定量PCR反应的模板。荧光定量PCR反应根据TaKaRa公司的荧光定量分析试剂盒TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)来进行。采用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪对马铃薯CGA合成关键酶基因StHQT进行表达检测,以马铃薯的Actin基因作为内参基因[16],用Vector NTI软件来设计引物,序列如表1。采用2−ΔΔCT法对目的基因进行相对定量差异表达分析。

    表  1  引物序列
    Table  1.  Primers sequences
    基因上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′)
    ActinCACCCACACTGTCCCCATCTGTCACGGCCAGCCAAGTC
    StHQTTGGAGATATCTCAACCTTTCCACTCGGACCATCGGATAACGTGTGGAATACT
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    试验数据统计分析采用SPSS 11.5软件,采用Sigmaplot 12.5软件进行绘图,图表中的小写字母表示邓肯氏新复极差测验在P=0.05水平上呈显著性差异。

    经叶面喷施水杨酸处理后,马铃薯叶片内绿原酸含量变化如图1所示。从图中可以看出,0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理都能明显提高马铃薯叶片内的绿原酸含量,而1 mmol/L SA处理的效果不太明显。处理后6 h时,0.01 mmol/L SA处理的马铃薯叶片中绿原酸含量剧增,显著高于其他组中绿原酸含量的水平(P<0.05);0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量也明显增加(P<0.05),但低于0.01 mmol/L SA处理的;而1 mmol/L SA处理的绿原酸含量有所下降。处理后12 h时,0.01 mmol/L SA处理的绿原酸含量继续增加至最高,显著高于其他2组处理的水平(P<0.05);0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量恢复到初始水平;1 mmol/L SA处理的绿原酸含量有所提高,但差异不显著。处理后24 h时,0.01 mmol/L SA处理的绿原酸含量恢复到初始水平,0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量也有轻微下降;此时0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量差异不明显,1 mmol/L SA处理绿原酸含量显著低于0.1 mmol/L SA处理的(P<0.05),但与0.01 mmol/L SA处理的差异不显著。

    图  1  叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片绿原酸含量的影响
    不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。
    Figure  1.  Effect of foliar application of SA on the content of CGA in S. tuberosum leaves

    经叶面喷施水杨酸处理后,马铃薯叶片内绿原酸合成关键酶基因HQT的表达变化见图2。处理后6 h时,0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量均有一定程度的增高,但差异不显著;1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量无明显变化。处理后12 h时,3个浓度SA处理的HQT基因表达量都明显增高,且0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量显著高于1 mmol/L SA处理的(P<0.05)。到处理后24 h时,3个浓度SA处理的HQT基因表达量都明显降低,但0.01 mmol/L SA处理的HQT基因表达水平仍显著高于其他2个浓度处理的(P<0.05)。

    图  2  叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片HQT基因表达的影响
    不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。
    Figure  2.  Effects of foliar application of SA on gene expression of HQT in S. tuberosum leaves

    SA是植物体内普遍存在的内源信号分子之一,在植物的生长、发育、成熟、衰老等生理过程以及抗盐、抗旱、抗低温、抗紫外线、抗重金属等抗逆反应的诱导中发挥着重要作用。SA能够有效促进植物细胞分裂和伸长,诱导一系列与抗逆有关的基因表达,提高植株体内保护酶活性,提高抗逆性,以缓解逆境胁迫下对植物造成的危害。此外,SA还能诱导植物对病毒、真菌及细菌等病原生物产生广谱而持久的抗性[17]

    叶面喷施是促进植物生长和次生代谢物积累的有效手段。在外源性水杨酸应用中,不同浓度对作物的影响效果不同,高浓度水杨酸会抑制植物的生长,只有在适宜的浓度下水杨酸才会对植物产生有利的影响。研究表明,15 mg/L的SA处理对菊花(Dendranthema morifolium)中总糖、总蛋白、总氨基酸、VC含量以及SOD活性都有不同程度的提高[18]。2 mmol / L的SA喷施丹参幼苗后,能有效调控蔗糖合成酶的活性,降低根中蔗糖合成酶的降解活性,从而增加蔗糖在丹参(Salvia miltiorrhiza)幼苗中的积累,并产生一定的影响[19]。0.1 mmol/L的外源SA能有效促进低温胁迫下黄瓜(Cucumis sativus)植株光合速率的增加,维持植株体内细胞膜的稳定性,从而使黄瓜植株在低温胁迫下良好的生长[20]。苗志奇等[21]的研究表明,0.1 mg/L的SA可以提高红豆杉(Taxus wallichiana var. chinensis)细胞培养体系中紫杉醇生物合成途径的代谢通量,使紫杉醇含量是对照组的4倍;当SA的浓度超过0.1 mg/L,紫杉醇和其他紫衫烷类物质都出现下降。李铂等[22]研究发现,叶面喷施0.5 mmol/L的SA能够促进当归(Angelica sinensis )幼苗生长,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等抗保护酶的活性,超过此浓度,植株生长受到抑制。王宏虬等[23]研究发现,SA在浓度为1.00 mmol/L时能显著提高马铃薯叶片中色素、可溶性蛋白及相关酶系(POD、CAT、PPO、PAL)含量,降低叶片中SAFR和MDA含量,增强马铃薯对疮痂病的抗性。本研究中,不同浓度SA处理对马铃薯叶片中绿原酸含量及HQT基因表达的影响不同:低浓度水杨酸(0.01 mmol/L)处理后,马铃薯叶片中的CGA含量明显提高,HQT基因的表达也被激活,与绿原酸变化趋势一致,表明HQT基因与绿原酸的生物合成有直接关系;中等浓度(0.1 mmol/L)的SA处理也明显提高了马铃薯叶片中HQT的表达量和CGA含量,但CGA含量的增幅低于0.01 mmol/L的SA处理;高浓度(0.1 mmol/L)的SA处理也在一定程度上促进了HQT基因的表达,但绿原酸的含量与处理前相比差异不大,表明只有适宜浓度的SA才能够促进马铃薯叶片绿原酸的合成与积累。本研究中马铃薯叶片的最佳处理浓度为0.01 mmol/L,与其他研究所使用的浓度存在一定差异,这可能是由于不同植物对SA的响应具有一定的差异造成的。

    绿原酸等酚类物质是普遍存在于植物体内的一类次生代谢产物,具有许多关键的生理功能,对植物的品质和产量起着重要的作用。随着科学研究的深入,酚类物质与植物抗病性之间的关系得到进一步证实,这个领域的研究近年来愈发引人注目。本研究以二倍体马铃薯为试验材料,采用叶面喷施的方式,探究马铃薯绿原酸及其合成关键酶基因HQT对抗病激素SA的响应情况,可为绿原酸在植物抗病方面的研究提供一定的参考。

  • 图  1   叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片绿原酸含量的影响

    不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

    Figure  1.   Effect of foliar application of SA on the content of CGA in S. tuberosum leaves

    图  2   叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片HQT基因表达的影响

    不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。

    Figure  2.   Effects of foliar application of SA on gene expression of HQT in S. tuberosum leaves

    表  1   引物序列

    Table  1   Primers sequences

    基因上游引物(5′→3′)下游引物(5′→3′)
    ActinCACCCACACTGTCCCCATCTGTCACGGCCAGCCAAGTC
    StHQTTGGAGATATCTCAACCTTTCCACTCGGACCATCGGATAACGTGTGGAATACT
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 修回日期:  2020-08-26
  • 网络出版日期:  2020-12-15
  • 发布日期:  2021-09-19

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