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Analysis of the Mitochondrial Genome of Eucryptorrhynchus Scrobiculatus (Coleoptera: Curculionidae) and a Phylogenetic Analysis of Curculionidae
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摘要: 利用二代测序方法获得了沟眶象线粒体基因组序列，并基于象甲科29个物种（内群）和叶甲科3个物种（外群）的37个线粒体基因核苷酸序列和13个蛋白质编码基因氨基酸序列，通过最大似然法和贝叶斯法构建了象甲科的系统发育树。结果表明：沟眶象的13个蛋白质编码基因只有nad1利用TTG作为起始密码子，其余蛋白质编码基因的起始密码子都以ATN起始；终止密码子除cox1和nad4以不完整的T结尾外，其余蛋白质编码基因都是以TAA 和TAG 作为终止密码子；除trnS1 因缺少DHU臂而形成一个简单的环，无法形成完整的三叶草形状，剩下的tRNA基因均能形成完整的三叶草形状；trnS1 的反密码子不是常见的GCU而是UCU。 2种系统发育分析产生相同的拓扑结构：隐喙象亚科、龟象亚科、魔喙象亚科、小蠹亚科、粗喙象亚科和隐颏象亚科为单系群，而象虫亚科为非单系群；沟眶象与Trigonopterus carinirostris + （T. jasminae + T. kotamobagensis）为姐妹群。本研究获得了沟眶象的线粒体基因组序列，重建了象甲科的系统发育关系，明确了沟眶象的系统发育位置，有利于更加全面地理解象甲科系统发育关系和线粒体基因组学。Abstract: The nearly complete mitochondrial genome of Eucryptorrhynchus scrobiculatus was sequenced by next-generation sequencing (NGS) method, and constructed the phylogenetic trees using Maximum Likelihood and Bayesian inference methods, based on the nucleotide sequences from mitochondrial genome of 37 genes and the amino acid sequences from thirteen protein-coding genes of 29 Curculionidae species (ingroup) and 3 Chrysomelidae species (outgroup). The findings revealed that most of protein-coding genes start with the codons of ATN except for the nad1 genes. The latter one protein-coding genes use TTG as start codons. While cox1 and nad4 employ the incomplete T as the stop codon, the remaining nine protein-coding genes terminate with TAA or TAG. All tRNA genes can be folded into typical cloverleaf structure, with the except of the trnS1-AGN. Both phylogenetic inference methods produced a similar tree topological structure: the subfamilie Cryptorhynchinae, Ceutorhynchina, Molytinae, Scolytinae, Entiminae and Dryophthorinae were monophyletic. However the subfamilies Curculioninae were non-monophyletic. The E. scrobiculatus is sister to Trigonopterus carinirostris + (T. jasminae + T. kotamobagensis). In this paper, we obtained the complete mitochondrial genome sequence of the E. scrobiculatus, reconstructed the phylogeny of the Curculionidae family, and clarified the phylogenetic position of the E. scrobiculatus, which is beneficial to a more comprehensive understanding of the phylogeny and mitochondrial genomics of the Curculionidae family.
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Keywords:
- Coloptera /
- Curculionidae /
- Eucryptorrhynchus scrobiculatus /
- mitochondrial genome /
- phylogeny
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沟眶象（Eucryptorrhynchus scrobiculatus）为鞘翅目象甲科（Curculionidae），是臭椿等树上危害较为严重的蛀干害虫，广泛分布于我国北京、河南、河北、陕西和江苏等地。象甲科是鞘翅目象甲总科中数量最多的1个科，约83000多个种，世界各地均有分布[1-2]。象甲科幼虫通常为白色，体长在2～70 mm不等；成虫因具有长长的口器和一对膝状触角而容易被识别。象甲科昆虫分布区域较广，食性较杂，幼虫和成虫均能钻入植物的根、茎、叶、花和果实中蛀食危害，严重时可导致作物绝产，造成严重的经济损失，是农林业生产中重点关注的害虫之一[3]。
线粒体基因组因组织结构相对保守常被应用于昆虫的分子进化、种群遗传以及系统发育等相关研究，通过运用二代测序技术，线粒体基因组可以很快被获得[4]。最近的许多研究已经证明使用线粒体基因组数据可以在不同分类水平上解析鞘翅目昆虫的系统发育关系[5-9]，但通过线粒体基因组对象甲科昆虫系统发育分析的报道较少，主要有张峰等[10]基于象甲科13个物种的线粒体基因组中的13个蛋白质编码基因的核苷酸矩阵和基于氨基酸矩阵构建象甲科的系统发育；陈英等[11]基于象甲科的39个物种线粒体基因组的蛋白质编码基因的核苷酸序列矩阵和基于氨基酸矩阵构建象甲科的系统发育关系。
本研究利用二代测序技术测序、组装得到了沟眶象的线粒体基因组数据，并结合已公布线粒体基因组的象甲科28个昆虫作为内群，3个叶甲科昆虫作为外群（表1），构建2个数据矩阵（PCGRNA和PCGaa），利用最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）构建象甲科的系统发育关系，明确沟眶象的系统发育位置，以期为更好地理解象甲科和沟眶象的系统发育提供线粒体基因组数据。
表 1 构建系统进化树的物种样本信息Table 1. Species sample information used in the phylogenetic tree construction in this study科 亚科 种名 基因组数据库编号 长度/bp 象甲科 Curculionidae 龟象亚科 Ceutorhynchinae 油菜豆荚象虫 Ceutorhynchus obstrictus MN180050 20124 隐喙象亚科 Cryptorhynchinae 沟眶象 Eucryptorrhynchus scrobiculatus OM744396 17436 Trigonopterus carinirostris MT653608 21007 Trigonopterus jasminae MT653603 17417 Trigonopterus kotamobagensis MT653609 18038 象虫亚科 Curculioninae 胡椒花象 Anthonomus eugenii MK654676 17257 梨花象 Anthonomus pomorum MK654677 17093 Anthonomus rectirostris MK654678 17676 Anthonomus rubi MK654679 17476 欧洲栗象 Curculio elephas KX087269 17591 Elaeidobius kamerunicus MT560591 17729 隐颏象亚科 Dryophthorinae 松瘤象甲 Sipalinus gigas MT809476 17120 米象 Sitophilus oryzae KX373615 17602 玉米象 Sitophilus zeamais MT294139 18531 粗喙象亚科 Entiminae 茶丽纹象甲 Myllocerinus aurolineatus MH197100 17762 Sitona obsoletus MH814932 17003 魔喙象亚科 Molytinae 筛孔二节象 Aclees cribratus MZ305480 17435 Aclees taiwanensis MZ305480 17435 板栗雪片象 Niphades castanea MT232762 17494 Pantoxystus rubricollis KX087330 17997 小蠹亚科 Scolytinae 肾点毛小蠹 Dryocoetes autographus KX035207 17055 Hylastes attenuatus KX035212 17409 六齿小蠹 Ips acuminatus MK988441 19580 Ips calligraphus MW589547 19144 Orthotomicus laricis KX035213 18887 罗汉肤小蠹 Phloeosinus perlatus MW447510 17054 Pityogenes bidentatus KX035211 18781 Pityophthorus pubescens KX035209 17316 Trypophloeus asperatus KX035204 17039 外群 Acanthoscelides obtectus MF925724 26613 Callosobruchus analis KY856745 24832 Callosobruchus chinensis KY856744 24496 1. 材料与方法
1.1 标本采集和DNA提取
供试沟眶象幼虫标本于2020年6月采集自河南省郑州市，将标本浸泡在95%的乙醇溶液中，置于−80 ℃超低温冰箱保存，用于DNA提取。使用基因组试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）提取沟眶象的DNA，使用NanoDrop 2000分光光度计（赛默飞，美国）检测DNA的质量，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度。
1.2 二代测序与线粒体基因组组装
将大于10 ng/μL的质量合格的DNA送往上海派森诺生物科技有限公司进行二代测序，利用全基因组鸟枪法（WGS）进行小片段文库的构建，使用Illumina HiSeq 2500 测序平台对构建的文库进行双末端（2 × 150 bp PE）测序，获得约2Gb 的原始数据，将原始数据进行质量控制，通过 Geneious v 11.1.15[12]软件以沟眶象的cox1基因作为参考，数据进行组装和拼接后，获得沟眶象的线粒体基因组的序列。
1.3 线粒体基因组的注释和分析
利用沟眶象的线粒体基因组数据在MITOS[13]网站上进行线粒体基因组注释，选用无脊椎动物参数进行设置。通过比对其他象甲科物种的线粒体基因组序列，手动矫正13个蛋白质编码基因（cox1、cox2、cox3、cytb、atp6、atp8、nad1、nad2、nad3、nad4、nad4l、nad5和nad6）、转运RNA基因、16S和12S核糖体基因的基因边界（表2）。将正确的线粒体基因组序列上传至GenBank（序列号：OM744396）。运用MEGA 7.0[14]软件计算沟眶象线粒体基因组核苷酸组成以及密码子的使用。利用AT−skew = (A − T) /(A + T)和 GC−skew = (G − C) /(G + C) 法则分别计算 AT 偏倚和 GC 偏倚。
表 2 沟眶象线粒体基因组注释Table 2. Annotation of the mitochondrial genome of E. scrobiculatus基因 基因长度/
bp起始位置/
bp终止位置/
bp起始
密码子终止
密码子编码链 trnI 65 1 65 H trnQ 68 854 787 L trnM 70 874 943 H nad2 1011 944 1954 ATT TAA H trnW 70 1954 2023 H trnC 68 2105 2038 L trnY 63 2194 2132 L cox1 1540 2187 3726 ATT T H trnL2 65 3727 3791 H cox2 684 3792 4475 ATT TAA H trnK 72 4478 4549 H trnD 64 4549 4612 H atp8 156 4613 4768 ATT TAA H atp6 675 4762 5436 ATG TAA H cox3 783 5436 6218 ATG TAA H trnG 65 6223 6287 H nad3 354 6288 6641 ATT TAA H trnA 68 6645 6712 H trnR 66 6712 6777 H trnN 64 6776 6839 H trnS1 67 6840 6906 H trnE 64 6906 6969 H trnF 66 7041 6976 L nad5 1725 8765 7041 ATT TAA L trnH 66 8831 8766 L nad4 1330 10161 8832 ATA T L nad4l 294 10451 10158 ATG TAA L trnT 65 10457 10521 H trnP 64 10585 10522 L nad6 507 10588 11094 ATT TAA H Cob 1140 11095 12234 ATG TAA H trnS2 68 12234 12301 H nad1 951 13322 12372 TTG TAG L trnL1 66 13389 13324 L rrnL 824 14221 13398 L trnV 66 14290 14225 L rrnS 782 15557 14776 L 控制区 1879 15558 17436 非编码序列 注: H表示正链； L表示负链； T 表示不完全密码子。 1.4 多序列比对
利用MAFFT软件对37个基因的核苷酸序列和蛋白质编码基因的氨基酸序列分别进行多序列比对[15]，使用trimAl v1.4对质量差的序列进行去除和对齐[16]，运用FASconCAT−G_v1.04对数据进行分别串联获得数据矩阵[17]。用于系统发育分析的数据矩阵包括：1）线粒体基因组的37个基因序列构建的数据矩阵（PCGRNA）用于最大似然法分析； 2）13 个蛋白质编码基因的氨基酸序列构建的数据矩阵（PCG_aa）用于贝叶斯法分析。
1.5 系统发育分析
利用最大似然法和贝叶斯法2种系统发育分析方法构建象甲科的系统发育关系。利用 IQ−TREE 2.0.6[18] 进行最大似然法分析：自动筛选GTR + F + I + G4为系统发育树最优模型，系统发育树的节点支持率通过自举检验置信度进行评估（运行次数设置为10000）。使用MrBayes v 3.2 进行贝叶斯法分析[19]。使用四条蒙特卡罗马尔柯夫链（MCMC）进行运算，并同时运行2 × 106代，每1000代抽样一次，丢弃25%，构建多数一致树。
2. 结果与分析
2.1 线粒体基因组分析
沟眶象的线粒体基因组结构利用OGDRAW[20]进行绘制（图1）。沟眶象的线粒体基因组全长为17 436 bp，A + T含量为77.6%，G + C含量为22.4%，具有丰富的AT含量值，其线粒体基因组包含37个基因和1段控制区，其中控制区位于 rrnS和trnI之间，长度为1 879 bp。沟眶象的蛋白质编码基因、rRNA和tRNA的AT含量在75.2%～81%，具有丰富的AT含量值。AT偏倚和GC偏倚在−0.194～0.035和−0.195～0.42（表3）。
表 3 沟眶象线粒体基因组的核苷酸组成和偏倚Table 3. Nucleotide composition and skewness of the E. scrobiculatus mitochondrial genomeFeature 特征 长度/bp AT/% AT偏倚 GC偏倚 PCGs−H 6849 75.2 −0.100 −0.195 PCGs−L 4299 78.9 −0.194 0.240 rRNAs−L 1606 77.6 −0.002 0.313 tRNAs−H 933 77.8 0.030 −0.034 tRNAs−L 527 81.0 0.035 0.420 注: PCGs表示蛋白质编码基因；rRNAs表示核糖体RNA；tRNAs表示转运RNA；H表示重链；L表示轻链。 2.2 蛋白质编码基因分析
沟眶象线粒体基因组的13个蛋白质编码基因中A + T含量为76.3%，G + C含量为23.7%。位于正链的蛋白质编码基因长为6 849 bp，A + T含量为75.2%，G + C含量为24.8%，AT偏倚为−0.1，GC偏倚为−0.195。位于负链的蛋白质编码基因长为4 299 bp，A + T含量为78.9%，G + C含量为21.1%，AT偏倚为−0.194，GC偏倚为0.24。
13个蛋白质编码基因的起始密码子中，仅有nad1利用TTG作为起始密码子，剩下的12个蛋白质编码基因都是以典型的ATN密码子开头。终止密码子除cox1和nad4以不完整的T结尾外，其余蛋白质编码基因都是以TAA 和TAG 结尾。在所有蛋白质编码基因的氨基酸使用中，苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly） 有较高的使用频率，平均使用比例为43.649%、32.650%、12.335%、11.355%。精氨酸的使用比例较低，仅为0.009%。此外，沟眶象线粒体基因组的密码子使用中，UUA密码子使用次数最多（373次），详见表4。
表 4 沟眶象线粒体基因组的相对密码子使用频率Table 4. Relative synonymous codon usage of the mitochondrial genome of E. scrobiculatus密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU UUU(F) 301 1.8 UCU(S) 112 2.82 UAU(Y) 148 1.84 UGU(C) 24 2.00 UUC(F) 34 0.2 UCC(S) 7 0.18 UAC(Y) 13 0.16 UGC(C) 0 0 UUA(L) 373 4.22 UCA(S) 90 2.26 UAA(*) 0 0 UGA(W) 83 1.98 UUG(L) 25 0.28 UCG(S) 5 0.13 UAG(*) 0 0 UGG(W) 1 0.02 CUU(L) 77 0.87 CCU(P) 70 2.30 CAU(H) 58 1.66 CGU(R) 13 1.02 CUC(L) 14 0.16 CCC(P) 7 0.23 CAC(H) 12 0.34 CGC(R) 3 0.24 CUA(L) 36 0.41 CCA(P) 42 1.38 CAA(Q) 54 1.83 CGA(R) 33 2.59 CUG(L) 5 0.06 CCG(P) 3 0.10 CAG(Q) 5 0.17 CGG(R) 2 0.16 AUU(I) 321 1.81 ACU(T) 84 2.09 AAU(N) 152 1.84 AGU(S) 18 0.45 AUC(I) 34 0.19 ACC(T) 10 0.25 AAC(N) 13 0.16 AGC(S) 1 0.03 AUA(M) 208 1.88 ACA(T) 64 1.59 AAA(K) 104 1.82 AGA(S) 79 1.99 AUG(M) 13 0.12 ACG(T) 3 0.07 AAG(K) 10 0.18 AGG(S) 6 0.15 GUU(V) 52 1.45 GCU(A) 69 2.00 GAU(D) 49 1.81 GGU(G) 59 1.30 GUC(V) 6 0.17 GCC(A) 10 0.29 GAC(D) 5 0.19 GGC(G) 8 0.18 GUA(V) 77 2.15 GCA(A) 57 1.65 GAA(E) 70 1.77 GGA(G) 106 2.33 GUG(V) 8 0.22 GCG(A) 2 0.06 GAG(E) 9 0.23 GGG(G) 9 0.20 注：RSCU表示相对密码子使用频率； *表示终止密码子。 2.3 tRNA和rRNA基因分析
沟眶象线粒体基因组的22个tRNA基因的序列长度为63～72 bp，其中trnY基因最短为63 bp，trnK 基因最长为72 bp。22个tRNA基因中，14个tRNA基因位于H链，全长为933 bp，A + T含量为77.8%，G + C含量为22.2%，AT偏倚为0.03，GC偏倚为−0.034。8个tRNA基因位于L链，全长为527 bp，A + T含量为81%，G + C含量为19%，AT偏倚为0.035，GC偏倚为0.42。 rrnL基因位于trnL1基因和trnV基因之间，rrnS基因位于trnV基因和trnI基因之间，rrnL和rrnS基因位于L链。沟眶象线粒体基因组位于正负链的tRNA基因和rRNA基因均具有较丰富的AT含量值（表2）。除trnS1基因由于缺少二氢尿嘧啶臂而形成一个简单的环，无法形成完整的三叶草形状，其余tRNA基因均能形成完整的三叶草结构。此外，trnS1的反密码子不是常见的GCU密码子，而是密码子UCU。
2.4 线粒体基因组的系统发育信号检测
本研究使用DAMBE[21]软件对使用的32个物种的线粒体基因组的核苷酸序列分别进行替代饱和度检测，结果显示，这些线粒体基因组的核苷酸序列都没有出现碱基饱和。因此，可用于象甲科的系统发育树的构建，详细结果见表5。
表 5 利用DAMBE 检测 PCGs、tRNA 和 rRNA 序列的碱基替代饱和性Table 5. Sequence saturation test of PCGs, tRNA and rRNA performed by DAMBE可操作分类单元数量 替代饱和指数 假设拓扑结构对称 概率 假设拓扑结构不对称 概率 32taxa−PCGs 32 0.417 0.817 0.000 0.571 0.000 32taxa−tRNA 32 0.392 0.775 0.000 0.493 0.000 32taxa−rRNA 32 0.441 0.788 0.000 0.517 0.000 2.5 系统发育分析
本研究选择叶甲科的3个昆虫（Acanthoscelides obtectus、Callosobruchus analis 和 Callosobruchus chinensis）作为外群，象甲科的29个昆虫作为内群的线粒体基因组的PCGRNA数据矩阵和PCGaa数据矩阵，分别使用最大似然法和贝叶斯法构建象甲科的系统发育关系。基于2种推断方法的系统发育分析结果见图2～3。这2种矩阵构建的系统发育树的拓扑结构基本相同。2种不同的系统发育分析一致支持隐喙象亚科Cryptorhynchinae、龟象亚科Ceutorhynchina、魔喙象亚科Molytinae、小蠹亚科Scolytinae、粗喙象亚科Entiminae和隐颏象亚科 Dryophthorinae 为单系群，而象虫亚科Curculioninae为非单系群。在最大似然法分析中，龟象亚科与象虫亚科形成一枝，但具有相对低的节点支持值（BS=80）。然而，在贝叶斯法分析中，龟象亚科与魔喙象亚科同样出现较低的节点支持值，后验概率PP=0.76。沟眶象的系统发育关系中，2种系统发育分析结果都支持沟眶象与Trigonopterus carinirostris + （T. jasminae + T. kotamobagensis）形成姐妹群关系，且具有较高的节点支持值（BS=100，PP=1）。
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图 2 基于37个线粒体基因的核苷酸序列构建的最大似然树Figure 2. Maximum likelihood tree inferred from the nucleotide sequences of 37 mitochondrial genes![]()
图 3 基于13个蛋白编码基因的氨基酸序列构建的贝叶斯树Figure 3. Bayesian tree inferred from the amino acid sequences of 13 protein-coding genes3. 结论与讨论
本研究测序获得的沟眶象线粒体基因组序列全长为17436 bp，共包含13个蛋白质编码基因，22个tRNA基因和2个rRNA基因。其线粒体基因组的基因排列顺序和假定同一祖先不同昆虫的线粒体基因组的排列顺序相同[22]。沟眶象线粒体基因组中的13个蛋白质编码基因的起始密码子除nad1基因外，都是典型的ATN（即ATT、ATA 和 ATG）作为起始，终止密码子除cox1和nad4以不完整的T结尾外，其余蛋白质编码基因都是以TAA 和TAG 结尾。
13个蛋白质编码基因的起始密码子只有nad1利用TTG作为起始，其余12个蛋白质编码基因都是以典型的ATN密码子开头，这种起始密码子使用现象在其他鞘翅目昆虫也出现过[9]。终止密码子除cox1和nad4以不完整的T结尾外，其余蛋白质编码基因都是以TAA 和TAG 结尾。这种不完整的终止密码进行结尾的现象通常被认为由mRNA转录后，由起始端的碱基将终止密码子补充完整。
沟眶象线粒体基因组中的22个tRNA基因，除trnS1 因缺少DHU臂而形成一个简单的环，无法形成完整的三叶草结构外，其余tRNAs均能形成完整的三叶草结构，这种现象在其他昆虫中也有出现[23-24]。此外，trnS1 的反密码子不是常见的GCU而是UCU，这种情况被猜测可能是多食亚目的一个共源性状[25]。
本研究以象甲科的29个物种作为内群，叶甲科的3个物种作为外群，结合已公布的32个物种的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列构建矩阵，利用贝叶斯法以及线粒体基因组的37个基因的核苷酸序列构建矩阵，使用最大似然法构建系统发育树，两个矩阵构建的系统发育树的结果均表明隐喙象亚科、龟象亚科、魔喙象亚科、小蠹亚科、粗喙象亚科和隐颏象亚科为单系群。这个结果与张峰等[10]基于象甲科13个物种的线粒体基因组中的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列和基于氨基酸利用最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树结果一致；与陈英等[11]基于象甲科39个物种线粒体基因组的蛋白质编码基因的核苷酸序列和基于氨基酸序列利用邻接法和最大似然法构建的系统发育树结果一致。
本研究中系统发育结果显示象虫亚科被恢复为非单系群。在张峰等[10]的研究中象虫亚科只有1个物种被用于象甲科的系统发育关系的研究，因而对于象虫亚科的单系性仍然是不确定的；陈英等[11]用于象甲科系统发育关系的研究中，只有象虫亚科2个物种被用于系统发育分析，并且这2个物种为同一个属，系统发育关系显示象虫亚科为单系群。本研究选取了目前已公布的所有象虫亚科物种包含3个属6个种的37个线粒体基因的核苷酸数据和13个蛋白质编码基因的氨基酸数据，利用最大似然法和贝叶斯法的系统发育结果，支持象虫亚科为非单系群。
本研究利用二代测序技术获得了沟眶象的线粒体基因组，详细注释和分析了沟眶象的线粒体基因组的结构特点，确定了沟眶象与T. carinirostris + （T. jasminae + T. kotamobagensis）的姐妹群关系，丰富了象甲科的线粒体基因组数据，为后续象甲科的系统发育以及沟眶象的种群遗传学等研究提供了线粒体基因组数据。
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图 2 基于37个线粒体基因的核苷酸序列构建的最大似然树
Figure 2. Maximum likelihood tree inferred from the nucleotide sequences of 37 mitochondrial genes
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图 3 基于13个蛋白编码基因的氨基酸序列构建的贝叶斯树
Figure 3. Bayesian tree inferred from the amino acid sequences of 13 protein-coding genes
表 1 构建系统进化树的物种样本信息
Table 1 Species sample information used in the phylogenetic tree construction in this study
科 亚科 种名 基因组数据库编号 长度/bp 象甲科 Curculionidae 龟象亚科 Ceutorhynchinae 油菜豆荚象虫 Ceutorhynchus obstrictus MN180050 20124 隐喙象亚科 Cryptorhynchinae 沟眶象 Eucryptorrhynchus scrobiculatus OM744396 17436 Trigonopterus carinirostris MT653608 21007 Trigonopterus jasminae MT653603 17417 Trigonopterus kotamobagensis MT653609 18038 象虫亚科 Curculioninae 胡椒花象 Anthonomus eugenii MK654676 17257 梨花象 Anthonomus pomorum MK654677 17093 Anthonomus rectirostris MK654678 17676 Anthonomus rubi MK654679 17476 欧洲栗象 Curculio elephas KX087269 17591 Elaeidobius kamerunicus MT560591 17729 隐颏象亚科 Dryophthorinae 松瘤象甲 Sipalinus gigas MT809476 17120 米象 Sitophilus oryzae KX373615 17602 玉米象 Sitophilus zeamais MT294139 18531 粗喙象亚科 Entiminae 茶丽纹象甲 Myllocerinus aurolineatus MH197100 17762 Sitona obsoletus MH814932 17003 魔喙象亚科 Molytinae 筛孔二节象 Aclees cribratus MZ305480 17435 Aclees taiwanensis MZ305480 17435 板栗雪片象 Niphades castanea MT232762 17494 Pantoxystus rubricollis KX087330 17997 小蠹亚科 Scolytinae 肾点毛小蠹 Dryocoetes autographus KX035207 17055 Hylastes attenuatus KX035212 17409 六齿小蠹 Ips acuminatus MK988441 19580 Ips calligraphus MW589547 19144 Orthotomicus laricis KX035213 18887 罗汉肤小蠹 Phloeosinus perlatus MW447510 17054 Pityogenes bidentatus KX035211 18781 Pityophthorus pubescens KX035209 17316 Trypophloeus asperatus KX035204 17039 外群 Acanthoscelides obtectus MF925724 26613 Callosobruchus analis KY856745 24832 Callosobruchus chinensis KY856744 24496 
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表 2 沟眶象线粒体基因组注释
Table 2 Annotation of the mitochondrial genome of E. scrobiculatus
基因 基因长度/
bp起始位置/
bp终止位置/
bp起始
密码子终止
密码子编码链 trnI 65 1 65 H trnQ 68 854 787 L trnM 70 874 943 H nad2 1011 944 1954 ATT TAA H trnW 70 1954 2023 H trnC 68 2105 2038 L trnY 63 2194 2132 L cox1 1540 2187 3726 ATT T H trnL2 65 3727 3791 H cox2 684 3792 4475 ATT TAA H trnK 72 4478 4549 H trnD 64 4549 4612 H atp8 156 4613 4768 ATT TAA H atp6 675 4762 5436 ATG TAA H cox3 783 5436 6218 ATG TAA H trnG 65 6223 6287 H nad3 354 6288 6641 ATT TAA H trnA 68 6645 6712 H trnR 66 6712 6777 H trnN 64 6776 6839 H trnS1 67 6840 6906 H trnE 64 6906 6969 H trnF 66 7041 6976 L nad5 1725 8765 7041 ATT TAA L trnH 66 8831 8766 L nad4 1330 10161 8832 ATA T L nad4l 294 10451 10158 ATG TAA L trnT 65 10457 10521 H trnP 64 10585 10522 L nad6 507 10588 11094 ATT TAA H Cob 1140 11095 12234 ATG TAA H trnS2 68 12234 12301 H nad1 951 13322 12372 TTG TAG L trnL1 66 13389 13324 L rrnL 824 14221 13398 L trnV 66 14290 14225 L rrnS 782 15557 14776 L 控制区 1879 15558 17436 非编码序列 注: H表示正链； L表示负链； T 表示不完全密码子。
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表 3 沟眶象线粒体基因组的核苷酸组成和偏倚
Table 3 Nucleotide composition and skewness of the E. scrobiculatus mitochondrial genome
Feature 特征 长度/bp AT/% AT偏倚 GC偏倚 PCGs−H 6849 75.2 −0.100 −0.195 PCGs−L 4299 78.9 −0.194 0.240 rRNAs−L 1606 77.6 −0.002 0.313 tRNAs−H 933 77.8 0.030 −0.034 tRNAs−L 527 81.0 0.035 0.420 注: PCGs表示蛋白质编码基因；rRNAs表示核糖体RNA；tRNAs表示转运RNA；H表示重链；L表示轻链。
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表 4 沟眶象线粒体基因组的相对密码子使用频率
Table 4 Relative synonymous codon usage of the mitochondrial genome of E. scrobiculatus
密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU 密码子 数量 RSCU UUU(F) 301 1.8 UCU(S) 112 2.82 UAU(Y) 148 1.84 UGU(C) 24 2.00 UUC(F) 34 0.2 UCC(S) 7 0.18 UAC(Y) 13 0.16 UGC(C) 0 0 UUA(L) 373 4.22 UCA(S) 90 2.26 UAA(*) 0 0 UGA(W) 83 1.98 UUG(L) 25 0.28 UCG(S) 5 0.13 UAG(*) 0 0 UGG(W) 1 0.02 CUU(L) 77 0.87 CCU(P) 70 2.30 CAU(H) 58 1.66 CGU(R) 13 1.02 CUC(L) 14 0.16 CCC(P) 7 0.23 CAC(H) 12 0.34 CGC(R) 3 0.24 CUA(L) 36 0.41 CCA(P) 42 1.38 CAA(Q) 54 1.83 CGA(R) 33 2.59 CUG(L) 5 0.06 CCG(P) 3 0.10 CAG(Q) 5 0.17 CGG(R) 2 0.16 AUU(I) 321 1.81 ACU(T) 84 2.09 AAU(N) 152 1.84 AGU(S) 18 0.45 AUC(I) 34 0.19 ACC(T) 10 0.25 AAC(N) 13 0.16 AGC(S) 1 0.03 AUA(M) 208 1.88 ACA(T) 64 1.59 AAA(K) 104 1.82 AGA(S) 79 1.99 AUG(M) 13 0.12 ACG(T) 3 0.07 AAG(K) 10 0.18 AGG(S) 6 0.15 GUU(V) 52 1.45 GCU(A) 69 2.00 GAU(D) 49 1.81 GGU(G) 59 1.30 GUC(V) 6 0.17 GCC(A) 10 0.29 GAC(D) 5 0.19 GGC(G) 8 0.18 GUA(V) 77 2.15 GCA(A) 57 1.65 GAA(E) 70 1.77 GGA(G) 106 2.33 GUG(V) 8 0.22 GCG(A) 2 0.06 GAG(E) 9 0.23 GGG(G) 9 0.20 注：RSCU表示相对密码子使用频率； *表示终止密码子。
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表 5 利用DAMBE 检测 PCGs、tRNA 和 rRNA 序列的碱基替代饱和性
Table 5 Sequence saturation test of PCGs, tRNA and rRNA performed by DAMBE
可操作分类单元数量 替代饱和指数 假设拓扑结构对称 概率 假设拓扑结构不对称 概率 32taxa−PCGs 32 0.417 0.817 0.000 0.571 0.000 32taxa−tRNA 32 0.392 0.775 0.000 0.493 0.000 32taxa−rRNA 32 0.441 0.788 0.000 0.517 0.000
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1. 刘彩霞，王慧敏，张美丽，梁玲瑜，蔡泱莲，汪杨，王正，吕全. 钝翅细小蠹对樟子松的危害及其传播松枯梢病的潜在作用. 林业科学. 2025(01): 17-25 . 
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