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LC−MS Analysis of Secondary Metabolites in the Callus of Vaccinium dunalianum
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摘要:
以樟叶越桔健康愈伤组织为研究对象，采用LC−MS联用技术，对樟叶越桔愈伤组织的甲醇提取物进行分析。结果表明：正离子模式下共检测出14类共281个化合物，以萜类、生物碱类、有机酸、杂环化合物、糖苷类和醇类为主，化合物数量分别为58、41、28、24、22个和13个，相对含量分别为16.866%、13.711%、6.108%、10.138%、12.488%和17.513%；负离子模式下检测出13类共71个化合物，以生物碱类、有机酸、糖苷类、萜类和酯类为主，化合物数量分别为14、9、9、7个和7个，相对含量分别为5.839%、72.653%、3.423%、2.062%和2.735%，其中丙酮酸的相对含量高达47.474%。研究结果可为进一步开展樟叶越桔愈伤组织中主要化学成分的生产调控等研究提供参考。
Abstract:The investigation focused on the healthy callus of Vaccinium dunalianum, and the methanol content was analyzed using LC−MS technology. The results showed that a total of 281 compounds divided into 14 categories were detected in the positive ion mode, which mainly including 58 terpenoids, 41 alkaloids, 28 organic acids, 24 heterocyclic compounds, 22 glycosides and 13 alcohols, with a relative content of 16.866%, 13.711%, 6.108%, 10.138%, 12.488% and 17.513%, respectively. A total of 71 compounds divided into 13 categories were detected in the negative ion mode, among which 14 alkaloids, 9 organic acids, 9 glycosides, 7 terpenoids and 7 esters were the main components with a relative content of 5.839%, 72.653%, 3.423%, 2.062% and 2.735%, respectively. Especially, the relative content of pyruvic acid was the highest at 47.474%. The results will provide a basis for the further regulation of the major chemical constituents in the callus of V. dunalianum.
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Keywords:
- Vaccinium dunalianum /
- callus /
- chemical constituent /
- secondary metabolism /
- LC−MS
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樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）为杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）常绿野生灌木[1]，其全株可药用，具有祛风除湿、舒筋活络等功效[2]，在我国主要分布于云南、四川、贵州和西藏等地[3-4]。Zhao等[5]在2008年首次对樟叶越桔叶芽开展了化学成分的分析研究，发现6'−O−咖啡酰熊果苷（CA）、绿原酸和熊果苷为其主要化学成分，且CA的得率高达22%。熊果苷是美白产品中主要活性成分，具有抑制黑色素生成、抗炎、抗氧化等功效，被广泛应用于化妆品行业[6-10]。斑马鱼试验研究表明，CA的抗黑色素生成能力为熊果苷的2倍，毒性仅为熊果苷的一半，表明CA有望能够作为更加安全有效的皮肤增白剂成分，具有良好的开发及应用前景[11]。近年来，由于市场需求日益增加，樟叶越桔不断遭受破坏性采摘，导致其现存资源逐年递减，开展离体组织培养的相关研究，将有利于其野生资源保护及其主效活性物质的进一步开发和利用。
植物离体组织培养技术作为现代生物技术手段，具有繁殖周期短、优良性状保存良好、成本低、不受季节限制等优势，对于野生植物资源的保护和栽培利用等具有重要意义[12]。本课题组先后建立了樟叶越桔组织苗的快繁体系[13]、不定根[14]、愈伤组织诱导及悬浮培养体系[15]，并对悬浮细胞培养条件与组培苗移栽技术进行了优化[16-17]，但对各组织培养系次生代谢产物的研究较少，仅尚俊可等[18]探讨了不同植物生长调节剂对樟叶越桔组培苗CA生长的影响，武波晓等[19]分析发现原花青素A2、儿茶素、马斯里酸、2−羟基齐墩果酸和樟叶越桔苷B为悬浮培养细胞中的主要次生代谢产物，对樟叶越桔愈伤组织次生代谢产物的研究尚未见报道。因此，本研究以樟叶越桔健康愈伤组织为研究对象，采用LC−MS联用技术，对樟叶越桔愈伤组织的甲醇提取物进行分析，以期阐明该培养体系中的主要化学成分，为进一步开展其主要成分的生产调控等提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料、仪器及试剂
1.1.1 实验材料
以樟叶越桔幼嫩叶片诱导出的愈伤组织为实验材料，经增殖培养5～8代稳定后供本研究使用，樟叶越桔幼嫩叶片取自本课题组前期培养的樟叶越桔组培苗[13]，其原始诱导外植体植物材料采自云南省武定县，参照付羚等[15]的方法进行愈伤组织的诱导及增殖培养。愈伤组织诱导培养基配方为改良WPM（3/5有机） + 2.0 mg/L 6−苄氨基腺嘌呤（6−BA） + 0.05 mg/L萘乙酸（NAA） + 2.0 mg/L 2,4−二氯苯氧乙酸（2,4−D） + 40 g/L蔗糖，愈伤组织增殖培养基为改良WPM（3/5有机） + 2.0 mg/L玉米素（ZT） + 0.4 mg/L NAA + 40 g/L蔗糖[15]。
1.1.2 仪器与试剂
超高效液相色谱仪（安捷伦科技公司，美国），QTOF 6550串联质谱仪（安捷伦科技公司，美国），D11961超纯水机（Thermo 公司，美国），DW−HL678超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司，中国），10N/A冷冻干燥机（新芝生物科技股份有限公司，中国），AR224CN万分之一电子天平（奥豪斯仪器有限公司，中国），SG250HPT超声仪（上海冠特超声仪器有限公司，中国），CF16RXII台式高速冷冻离心机（日立公司，日本），0.22 μm有机滤膜（新恩源生物技术有限公司，中国），分析纯甲醇（光华科技股份有限公司，中国），色谱纯乙腈（默克集团，德国），分析纯硝酸铵、硫酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钙、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、钼酸钠、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、甘氨酸（西陇化工有限公司，中国），优级纯肌醇、琼脂（上海致化化学科技有限公司，中国）、蔗糖（广东光华科技股份有限公司，中国），分析纯ZT、NAA（北京索莱宝科技有限公司，中国）。
1.2 实验方法
1.2.1 樟叶越桔愈伤组织甲醇提取物的制备
取生长状态良好的愈伤组织，用超纯水清洗2～3次后吸干水分冷冻干燥后研磨成粉末，准确称取100 mg于离心管中分3次加入3 mL 80%甲醇进行超声提取30 min，离心分离3次提取上清液合并定容至10 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后置于进样瓶中，供LC−MS检测分析。
1.2.2 UPLC−TOF−MS/MS检测方法
色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；流动相A为超纯水（含0.04%乙酸），B为乙腈（含0.04%乙酸）；梯度洗脱程序为5% B～95% B（0～11 min），95% B（11.1～12 min），5% B（12.1～15 min）；流速为0.4 mL/min。柱温40 ℃，进样量为5 μL。质谱条件：正负离子电喷雾离子源（ESI），温度为550 ℃，质谱电压为5500 V，帘气（CUR）为25 psi，扫描范围为70～1000 m/z。
1.3 数据处理
采用中药数据库对化合物进行谱图数据匹配鉴定[20]，使用面积归一法计算化合物的相对含量。
2. 结果与分析
2.1 正离子扫描模式下主要化合物分析
在正离子模式下，从樟叶越桔愈伤组织甲醇提取物中共检测出281个匹配度>90%的化合物，可分为14类，其中以萜类、生物碱类、有机酸、杂环化合物、糖苷类和醇类为主，化合物数量分别为58、41、28、24、22个和13个，相对含量分别为16.866%、13.711%、6.108%、10.138%、12.488%和17.513%。酮类、酚类、酯类、烃类、醛类、黄酮类、氨基酸及其他类化合物数量分别为17、13、12、12、8、8、8和17个，相对含量分别为3.736%、3.413%、6.155%、1.613%、1.161%、0.217%、1.945%和4.937%（图1）。其中相对含量大于1%的化合物有20个，包括醇类5个、糖苷4个、萜类3个、生物碱类3个、酯类2个、有机酸1个、杂环化合物1个，相对含量总和为45.852%（表1）。
图 图 1 各类别化合物的相对含量及数量（ESI + ）Figure 图 1. The relative content and quantity of each category of compounds (ESI + )表 表 1 相对含量大于1%的化合物（ESI + ）序号 化合物名称 匹配度/% 分子式 类别 相对含量/% 1 亚麻酸甘油酯Ⅱ 92.44 C39H64O5 酯类 2.729 2 15−甲基十六烷酸甲酯 96.82 C18H36O2 酯类 1.175 3 邻苯二甲酸酐 99.91 C8H4O3 杂环 4.169 4 β−紫罗兰酮 99.17 C13H20O 萜类 1.889 5 番石榴香豆酸 97.72 C39H54O7 萜类 1.518 6 (24Z)−27−羟基−3−氧代−7,24−甘遂二烯−22−醛 98.87 C30H46O3 萜类 1.226 7 二十二烷酸 97.18 C22H44O2 有机酸 1.039 8 洋芹苷 92.94 C20H24O10 糖苷 4.921 9 红霉素 93.39 C34H50O13 糖苷 1.551 10 7−O−乙酰基熊果苷 90.80 C14H18O8 糖苷 1.454 11 1−O−十六烷基−2−O−(9Z,12Z−十八二烯基)−3−O−α−D−吡喃半乳糖基−(1,7')−O−β−D−半乳糖 98.55 C49H88O15 糖苷 1.261 12 N−甲基石斛季铵碱 90.78 C17H28NO2 生物碱 2.085 13 2−(3−羟丙基)−3H−喹唑啉−4−酮 96.25 C11H12N2O2 生物碱 1.842 14 斯替宁碱 90.78 C17H27NO2 生物碱 1.816 15 3−甲氧基−8−甲基胡桃酮 99.14 C12H10O4 醌类 1.198 16 24−甲基胆甾−5,7,22−三烯−4β−醇 98.92 C28H44O 醇类 4.836 17 10−甲氧基十七烷−1−烯−4,6−二炔−3,10−二醇 91.76 C18H28O3 醇类 4.120 18 4−戊烯−2−醇 97.25 C5H10O 醇类 2.892 19 10−羟基异苦豆素−12−烯 92.00 C15H26O2 醇类 2.141 20 (8E)−十七烷−1,8−二烯−4,6−二炔−3,11−二醇 90.69 C17H24O2 醇类 1.989 合计 45.852 在正离子模式下，萜类化合物共检出58个，相对含量为16.866%，包括β−紫罗兰酮（1.889%）、番石榴香豆酸（1.518%）和(24Z)−27−羟基−3−氧代−7,24−甘遂二烯−22−醛（1.226%）等；生物碱类化合物共有41个，相对含量为13.711%，包括N−甲基石斛季铵碱（2.085%）、2−(3−羟丙基)−3H−喹唑啉−4−酮（1.842%）和斯替宁碱（1.816%）等；有机酸共有28个，相对含量占总和的6.108%，包括二十二烷酸（1.039%）、9,11−二羟基硬脂酸（0.799%）和阿立普酸（0.796%）等；杂环化合物共有24个，相对含量为10.138%，包括邻苯二甲酸酐（4.169%）、吲哚（0.923%）、4−羟基−2,6−二甲基−6−(3,7−二甲基−2,6−辛二烯基)−8−(3−甲基−2−丁烯基)−2H−1−苯并吡喃（0.906%）等；糖苷类共检测出22个，相对含量为12.488%，包括洋芹苷（4.921%）、红霉素（1.551%）、7−O−乙酰基熊果苷（1.454%）和1−O−十六烷基−2−O−(9Z,12Z−十八二烯基)−3−O−α−D−吡喃半乳糖基−(1,7')−O−β−D−半乳糖（1.261%）等；酮类、酚类、酯类、醇类、烃类和醛类的数量分别为17、13、12、13、12和8个，相对含量分别为3.736%、3.413%、6.155%、17.513%、1.613%和1.161%。酮类化合物包括环十二酮（0.982%）、苜蓿素B（0.761%）和3−羟基−2−丁酮（0.394%）等；酚类化合物包括1,3−萘二酚（0.787%）、7−姜烯酚（0.630%）、原花青素A2（0.450%）和羊红膻素F（0.431%）等；酯类化合物包括亚麻酸甘油酯Ⅱ（2.729%）、15−甲基十六烷酸甲酯（1.175%）和邻苯二甲酸二丁酯（0.641%）等；醇类化合物包括24−甲基胆甾−5,7,22−三烯−4β−醇（4.836%）、10−甲氧基十七烷−1−烯−4,6−二炔−3,10−二醇（4.120%）和4−戊烯−2−醇（2.892%）等；烃类化合物包括异烯丙基苯（0.720%）和1,1,4−三甲基环戊烷（0.262%）等；醛类化合物包括E−3−壬烯醛（0.416%）和松柏醛（0.405%）等。黄酮、氨基酸及其他类化合物的数量分别为8、8和17个，相对含量分别为0.217%、1.945%和4.937%。黄酮类化合物包括3,6−乙酰基坦布林（0.073%）和台湾山豆根色酮A（0.057%）等；氨基酸包括L−苯丙氨酸（0.650%）和L−高精氨酸（0.457%）等。其他类化合物包括苯丙素类6个、甾体类4个、醚类2个、核苷类2个、维生素类2个和醌类1个，相对含量分别为1.404%、1.754%、0.094%、0.179%、0.308%和1.198%。苯丙素包括3'−羟基肉桂醛（0.667%）、4−羟基香豆素（0.522%）和肉桂醛（0.154%）等；甾体包括酯蟾毒基−4−氢辛二酸酯（0.370%）和14α−甲基−5α−麦角甾−9(11),24(28)−二烯−4β−醇（0.560%）等；2个醚类及2个核苷分别是1−甲基−4−异丙氧基环己烷（0.018%）和木天蓼醚（0.076%）、腺苷（0.157%）和鸟苷（0.022%）；维生素和醌分别是维生素B6（0.299%）、维生素B3（0.009%）和3−甲氧基−8−甲基胡桃酮（1.198%）。
2.2 负离子扫描模式下主要化合物分析
在负离子扫描模式下共检测出71个匹配度>90%的化合物，可分为13类，以生物碱、有机酸、糖苷、萜类和酯类为主，化合物数量分别为14、9、9、7个和7个，相对含量分别为5.839%、72.653%、3.423%、2.062%和2.735%。杂环化合物、苯丙素、氨基酸、酮类、酚类、醇类、黄酮类及其他类化合物数量分别为5、3、3、3、3、2、2个和4个，相对含量分别为2.860%、1.379%、1.385%、0.503%、0.954%、0.833%、0.327%和5.046%（图2）。相对含量大于1%的化合物有12个，包括有机酸6个、生物碱2个、糖苷1个、萜类1个、杂环化合物1个和醌类1个，相对含量总和为81.801%（表2）。
图 图 2 各类别化合物的相对含量及数量（ESI−）Figure 图 2. The relative content and quantity of each category of compounds (ESI−)表 表 2 相对含量大于1%的化合物（ESI−）序号 化合物名称 匹配度/% 分子式 类别 相对含量/% 1 5−O−甲基信筒子醌 96.46 C18H28O4 醌类 4.306 2 咖啡因 97.21 C8H10N4O2 生物碱 1.200 3 D−卡西酮 93.82 C9H11NO 生物碱 1.197 4 香豆酸−β−D−葡萄糖苷 97.02 C15H18O8 糖苷 1.016 5 微莱平 93.19 C27H46O8 萜类 1.282 6 丙酮酸 95.45 C3H4O3 有机酸 47.474 7 柠檬酸 98.17 C6H8O7 有机酸 12.000 8 富马酸 97.68 C4H4O4 有机酸 6.039 9 苹果酸 95.62 C4H6O5 有机酸 3.001 10 灵芝−8−烯酸W 98.07 C34H52O7 有机酸 1.732 11 大马士革宁 93.82 C10H13NO3 有机酸 1.327 12 焦聚糖酸 95.45 C5H4O3 杂环 1.227 合计 81.801 在负离子检测模式下，14个生物碱类化合物的总相对含量为5.839%，其中含量较高的有D−卡西酮（1.197%）、咖啡因（1.200%）和山麻杆碱（0.593%）等；9个有机酸的相对含量合计为72.653%，其中丙酮酸（47.474%）、柠檬酸（12.000%）和富马酸（6.039%）等含量较高；糖苷类化合物共9个，相对含量为3.423%，其中香豆酸−β−D−葡萄糖苷（1.016%）、芹菜糖（0.520%）和草夹竹桃苷（0.470%）等的含量较高；7个萜类化合物的相对含量为2.062%，其中微莱平（1.282%）、西米苷E（0.308%）和紫杉碱K（0.187%）等含量较高；杂环化合物共5个，相对含量为2.860%，其中含量较高的化合物有焦聚糖酸（1.227%）、当归素（0.714%）和二氢山芹醇（0.458%）等。
酯类化合物共有7个，相对含量为2.735%，含量较高的有杜衡素B（0.721%）、3−(4−羟基苯基)−反式丙烯酸−2,3−二羟丙酯（0.483%）和1β−去氢浆果赤霉素VI（0.438%）等；酮类和酚类化合物各3个，相对含量分别为0.503%和0.954%，酮类化合物为2−三十一烷基−5−羟基−7−甲氧基色酮（0.384%）、21−羟基−30−去甲何帕−22−酮（0.069%）和3α−羟基丹参酮Ⅱ A（0.050%），酚类化合物为4,4'−二羟基二苯甲烷（0.398%）、没食子酰−L−表没食子儿茶酚（0.331%）和桑橙素（0.225%）；醇类化合物共2个，相对含量为0.954%，分别为3,5−二羟基−6,6−二甲基环己−2,4−二烯−1−酮（0.424%）和肌醇（0.409%）；苯丙素类化合物有2−甲氧基−4−(3−甲氧基−1−丙烯基)苯酚（0.705%）、1−甲氧基−4−(1−丙烯基)苯（0.631%）和肉桂酸肉桂酯（0.043%）；氨基酸为L−天冬酰胺（0.626%）、L−组氨酸（0.449%）和L−合欢氨酸（0.310%）；黄酮类有荩草素（0.232%）和苦参醇G（0.095%）；其他化合物分别是β−谷甾醇−α−葡萄糖苷（0.433%）、维生素B5（0.060%）、乙醛（0.247%）和5−O−甲基信筒子醌（4.306%）。
3. 结论与讨论
本研究采用LC−MS技术在正离子模式下共分析鉴定出281个化合物，其中以萜类（58个）、生物碱类（41个）、有机酸类（28个）、杂环化合物类（24个）、糖苷类（22个）和醇类（13个）为主，相对含量分别为16.866%、13.711%、6.108%、10.138%、12.488%和17.513%。在负离子模式下共鉴定出71个化合物，以生物碱（14个）、有机酸（9个）、糖苷（9个）、萜类（7个）和酯类（7个）为主，相对含量分别为5.839%、72.653%、3.423%、2.062%和2.735%。正离子模式下相对含量大于1%的化合物共有20个，相对含量总计为45.852%，负离子模式下共有12个相对含量大于1%的化合物，相对含量总计为81.801%，为樟叶越桔愈伤组织的主要代谢产物，其中相对含量最高的化合物为丙酮酸（47.474%），其次为柠檬酸（12.000%）、富马酸（6.039%）、洋芹苷（4.921%）、24−甲基胆甾−5,7,22−三烯−4β−醇（4.836%）、5−O−甲基信筒子醌（4.306%）、邻苯二甲酸酐（4.169%）、10−甲氧基十七烷−1−烯−4,6−二炔−3,10−二醇（4.120%）和苹果酸（3.001%）等。
值得注意的是樟叶越桔愈伤组织富含丙酮酸等有机酸类衍生物，研究发现，该类衍生物具有显著的抗氧化、抗菌、防腐、抗炎、抗病毒等多种生理活性，如柠檬酸具有抗菌、防腐等特性[21]，富马酸具有抗炎、抗肿瘤等生物活性[22]，丙酮酸作为次生代谢产物的前体物质，能够参与生物体内蛋白质、脂肪和糖的代谢，在生物体的代谢过程中发挥着重要作用[23-26]。丙酮酸及其盐还具有抗氧化、抗病毒等功效，在食品添加剂、生物制药行业得到广泛应用，如丙酮酸钙能够加速脂肪消耗达到减轻体重的功效，可用作膳食补充剂[27]，丙酮酸钠能够通过促进有氧代谢改善高强度耐力性运动所诱导的代谢性酸中毒，可作为一种有效的运动补剂使用[28]。因此，进一步阐明丙酮酸在樟叶越桔离体愈伤组织中的高产机制，可望为丙酮酸的绿色生产提供新的途径[29]。
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图 图 1 各类别化合物的相对含量及数量（ESI + ）
Figure 图 1. The relative content and quantity of each category of compounds (ESI + )
图 图 2 各类别化合物的相对含量及数量（ESI−）
Figure 图 2. The relative content and quantity of each category of compounds (ESI−)
表 表 1 相对含量大于1%的化合物（ESI + ）
序号 化合物名称 匹配度/% 分子式 类别 相对含量/% 1 亚麻酸甘油酯Ⅱ 92.44 C39H64O5 酯类 2.729 2 15−甲基十六烷酸甲酯 96.82 C18H36O2 酯类 1.175 3 邻苯二甲酸酐 99.91 C8H4O3 杂环 4.169 4 β−紫罗兰酮 99.17 C13H20O 萜类 1.889 5 番石榴香豆酸 97.72 C39H54O7 萜类 1.518 6 (24Z)−27−羟基−3−氧代−7,24−甘遂二烯−22−醛 98.87 C30H46O3 萜类 1.226 7 二十二烷酸 97.18 C22H44O2 有机酸 1.039 8 洋芹苷 92.94 C20H24O10 糖苷 4.921 9 红霉素 93.39 C34H50O13 糖苷 1.551 10 7−O−乙酰基熊果苷 90.80 C14H18O8 糖苷 1.454 11 1−O−十六烷基−2−O−(9Z,12Z−十八二烯基)−3−O−α−D−吡喃半乳糖基−(1,7')−O−β−D−半乳糖 98.55 C49H88O15 糖苷 1.261 12 N−甲基石斛季铵碱 90.78 C17H28NO2 生物碱 2.085 13 2−(3−羟丙基)−3H−喹唑啉−4−酮 96.25 C11H12N2O2 生物碱 1.842 14 斯替宁碱 90.78 C17H27NO2 生物碱 1.816 15 3−甲氧基−8−甲基胡桃酮 99.14 C12H10O4 醌类 1.198 16 24−甲基胆甾−5,7,22−三烯−4β−醇 98.92 C28H44O 醇类 4.836 17 10−甲氧基十七烷−1−烯−4,6−二炔−3,10−二醇 91.76 C18H28O3 醇类 4.120 18 4−戊烯−2−醇 97.25 C5H10O 醇类 2.892 19 10−羟基异苦豆素−12−烯 92.00 C15H26O2 醇类 2.141 20 (8E)−十七烷−1,8−二烯−4,6−二炔−3,11−二醇 90.69 C17H24O2 醇类 1.989 合计 45.852 
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表 表 2 相对含量大于1%的化合物（ESI−）
序号 化合物名称 匹配度/% 分子式 类别 相对含量/% 1 5−O−甲基信筒子醌 96.46 C18H28O4 醌类 4.306 2 咖啡因 97.21 C8H10N4O2 生物碱 1.200 3 D−卡西酮 93.82 C9H11NO 生物碱 1.197 4 香豆酸−β−D−葡萄糖苷 97.02 C15H18O8 糖苷 1.016 5 微莱平 93.19 C27H46O8 萜类 1.282 6 丙酮酸 95.45 C3H4O3 有机酸 47.474 7 柠檬酸 98.17 C6H8O7 有机酸 12.000 8 富马酸 97.68 C4H4O4 有机酸 6.039 9 苹果酸 95.62 C4H6O5 有机酸 3.001 10 灵芝−8−烯酸W 98.07 C34H52O7 有机酸 1.732 11 大马士革宁 93.82 C10H13NO3 有机酸 1.327 12 焦聚糖酸 95.45 C5H4O3 杂环 1.227 合计 81.801
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