随着城市人口的增长以及环境污染问题的日益突出，人们对城市园林绿化建设中的植物提出了更高的质量要求^[1−2]；同时，随着生态文明理念深入人心，彩叶植物在城市生态园林造景中越来越重要^[3]。因此，植物叶色研究显得尤为重要。色差值及色素含量是分析叶色的重要指标。Li等^[2]发现3个甜菜（Alternanthera bettzickiana）品种的形态基本相同，但叶片色差值及叶绿素和花青素含量存在明显差异，为后续转录组测序奠定了良好的生化基础。转录组测序是重要的分子生物学方法，在植物叶色研究中得到了广泛应用^[4−6]，为研究叶色形成的遗传机制提供了有价值的信息。

朱砂根（Ardisia crenata）在我国长江流域以南区域均有分布，在广西为广布种植物，是我国传统的观赏药用植物^[7−9]；红凉伞（Ardisia crenata var. bicolor）是朱砂根的变种，地理分布、观赏药用价值基本与朱砂根相同^[10−11]；两种植物同为报春花科（Primulaceae）紫金牛属（Ardisia）小灌木，主要区别在于叶色的过渡，其余形态无太大的差异性^[12−13]。目前，两种植物的研究主要集中在药理特性^[14−15]、次生代谢产物^{[9, 11, 8]}、遗传多样性^[16]、生长繁殖及生理响应^[17−18]等方面。关于两种植物的转录组测序，仅见刘雄伟等^[10]对二者叶绿体全基因组的测序，从分子水平为红凉伞作为朱砂根的变种提供了科学解释；杨君^[19]、路艳等^[20]基于转录组测序探索了朱砂根药用活性成分三萜皂苷的合成；Yan等^[13]对朱砂根进行叶绿体全基因组测序，获得cp基因组156876 bp，总GC含量37.10%。然而，关于两种植物叶片转录组测序特征的分析还尚未见报道。此外，前期物候观察发现，两种植物的成熟叶片有较稳定的叶色差异，且不随季节而变化。基于此，本研究拟以2年生朱砂根及红凉伞成熟叶片为实验材料，在色差值及色素含量测定的生化基础之上，进行转录组测序（Denovo_RNAseq）分析。旨在探究两种植物叶片的转录组特征，为后续深入挖掘叶色相关功能基因、分子标记辅助育种和遗传多样性研究等提供参考。

1.   材料和方法

1.1   试验材料

基于刘雄伟等^[11]研究，选取2年生朱砂根（图1a）和红凉伞（图1b）叶片作为试验材料。盆栽养护管理于玉林师范学院智慧农业学院温室大棚（110°20′E，22°68′N），土壤基本理化条件一致，园土为同一土块提供。V（园土）∶V（蛭石） ∶V（珍珠岩）=1∶1∶1。前期物候观察发现，一年中2种植物在10月中旬趋于稳定生长，当年新生叶片基本达到成熟状态，叶色相对稳定，且不随季节而变化，待第二年春继续发新梢、新芽和新叶，因此于10月中旬进行取样。首先，随机选取生长基本一致、健壮、无病虫害的朱砂根和红凉伞盆栽各9株。试验设3个重复，每重复从3株朱砂根和3株红凉伞盆栽植株的相同位置，摘取生长状态一致的成熟叶片，擦净，朱砂根叶片混合成样品S1，红凉伞叶片混合成样品S2。各样品再分成两份，一份用于色差值和色素含量测定，另一份液氮速冻1 min后干冰寄样至广州基迪奥生物科技有限公司在Illumina NovaSeq 6000测序平台上完成转录组测序。

图  1  四大数据库注释统计（a）及维恩图（b）

Figure  1.  Annotation statistics (a) and Venn diagram (b) of the four major databases

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1.2   实验方法

1.2.1   叶片色差值测定

参照Li等^[2]方法，用EOS 70D（W）相机拍摄叶片后，随机选取各叶片上的12个点（叶正面、叶背面各6个），避开叶柄和叶脉，用分光测色仪CS-660进行色差值测量。参照国际照明委员会提出的CELLAB测色标准^[21]，L^*值表示亮度（0～100，黑色到白色），值越大亮度越高；a^*值表示红/绿（−80−100，绿色到红色），负值偏绿且值越小绿色越深，正值偏红且值越大红色越深；b^*值表示黄/蓝（−80～100，蓝色到黄色），负值偏蓝且值越小蓝色越深，正值偏黄且值越大黄色越深；C^*值表示彩度值，值越高颜色越纯、越艳，C^* = (a^*2 + b^*2)^1/2。

1.2.2   色素含量测定

1）叶绿素（Chl）及类胡萝卜素（Car）含量测定。参照孙健等^[22]方法，叶片样品在95%乙醇溶液中室温避光浸提24 h后，在分光光度计（UV1800）中测定665、649、470 nm处吸光值（OD），重复3次。按如下公式计算色素浓度（mg/L）：

按如下公式计算色素含量（mg/g）：

其中，C为色素浓度（mg/L），V为提取液总体积（L），m为样品鲜质量（g）。

2）花青素含量测定。参照赵宇瑛等^[23]方法，叶片样品粉末经2次0.1 mol/L盐酸乙醇溶液离心后，合并上清液，并在分光光度计中测定530 nm、620 nm、650 nm处OD值。按如下公式计算花青素含量（mg/g）：

其中，OD_λ = (OD₅₃₀−OD₆₂₀)−0.1 × (OD₆₅₀−OD₆₂₀)，ε是花青素摩尔消光系数4.62 × 10⁴，V_t是提取液总体积（mL），m是取样质量（g），M为分子质量。

3）黄酮（除花青素外）含量测定。参照权春梅等^[24]方法，制备芦丁标曲y = 3.6192 x−0.0852 (R² = 0.9984)，其中x为芦丁对照品溶液浓度，y为吸光度。称取1 g待测样品，用60 mL 70%乙醇溶液浸泡20 min，超声波处理35 min后室温浸泡30 min，过滤，滤液定容至100 mL。精密吸取样品溶液1.0 mL，分别加入1% AlCl₃溶液4.0 mL，并用70%乙醇定容至25 mL摇匀，测定273 nm处吸光度。按如下公式计算黄酮含量（mg/g）：

其中，C是标曲中查得黄酮的含量（μg/g），N是稀释倍数，V_t是提取液总体积（mL），V_s为测定取液量（mL），m为样品称重量。

1.2.3   转录组测序

参照试剂盒说明进行样品总RNA提取及去除rRNA。通过NanoPhotometer spectrophotometer、Qubit 2.0 Fluorometer及Agilent 2100 bioanalyzer分别检测RNA纯度、精确定量RNA浓度及检测RNA完整性。通过带有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，用超声波把mRNA打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第2条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得上机文库，并上机测序。

1.2.4   转录组测序分析

利用fastp对下机reads进行过滤，并通过Trinity软件对reads完成数据组装。随后，通过BLAST软件将unigene序列比对到数据库Nr、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG，得到跟给定unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该unigene的蛋白功能注释信息。同时，将预测的蛋白序列同相应的转录因子数据库plant TFdb进行hmmscan比对。

1.2.5   SSR分析

使用软件MISA对转录组的所有unigene进行搜索，寻找unigene中的SSR位点。同时，根据找到的SSR信息使用primer3在SSR序列两侧进行引物设计。

1.3   数据分析

数据为平均值 ± 标准差，采用IBM SPSS Statistics 24（SPSS Inc.，Chicago，USA）软件进行统计分析，并采用Excel 2016软件制表作图。

2.   结果与分析

2.1   色差值分析

肉眼观察发现，2种植物叶片总体形态基本一致，但呈现出明显的叶色特征，朱砂根叶片为绿色，而红凉伞叶片叶正面为绿色、叶背面为（紫）红色。Lab颜色空间值分析显示（表1），朱砂根叶正面a^*值为-6.55、b^*值为13.20，叶背面a^*值为−5.28、b^*值为16.99，叶片为绿色；红凉伞叶正面a^*值为-4.46、b^*值为10.90，叶背面a^*值为10.72，显著高于其他叶面（P < 0.05），而b ^*值为3.49，显著低于其他叶面（p < 0.05），即红凉伞叶片叶正面为绿色、叶背面为红色；2种植物叶片叶正面亮度（L^*值)）均小于叶背面，且朱砂根叶片叶正面亮度显著小于叶背面（P < 0.05），同时朱砂根叶片叶背面亮度显著高于红凉伞（P < 0.05）；两种植物各自叶片叶正面和叶背面彩度值（C^*值）无显著性差异，朱砂根叶片叶背面彩度值显著高于红凉伞的叶正面和叶背面（P < 0.05）。结果表明，肉眼观察结果与色差仪测定的叶片Lab颜色空间值一致，朱砂根叶片为绿色，而红凉伞叶片叶正面为绿色、叶背面为（紫）红色。

表  1  2种植物叶片Lab颜色空间值

Table  1.  Lab color space values of leaves in two plants

样本	亮度值（L*）	红/绿值（a*）	黄/蓝值（b*）	彩度值（C*）
朱砂根（正面）	29.61 ± 2.21b	−6.55 ± 1.53b	13.20 ± 4.74a	14.73 ± 4.86ab
朱砂根（背面）	42.99 ± 0.94a	−5.28 ± 0.31b	16.99 ± 1.23a	17.81 ± 1.11a
红凉伞（正面）	29.82 ± 2.12b	−4.46 ± 1.48b	10.90 ± 2.91a	11.78 ± 3.25b
红凉伞（背面）	30.66 ± 3.74b	10.72 ± 1.92a	3.49 ± 3.35b	11.76 ± 0.40b
注：同列不同小写字母代表差异显著（P < 0.05）。

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2.2   色素含量分析

由表2可知，朱砂根叶片中的Chl a、Chl b、Chl和Car含量均高于红凉伞，但无显著差异，而红凉伞叶片中的花青素和总黄酮（除花青素外）含量则显著高于朱砂根中（P < 0.05），其中红凉伞叶片中花青素的含量几乎是朱砂根中的3倍。结果表明，两种植物叶片在叶色生理指标（色素含量）上表现出差异，可为后续转录组测序分析奠定基础。

表  2  2种植物叶片中色素含量

Table  2.  The pigment content of the leaves in two plants

样本	Chl a/ （mg﹒g−1）	Chl a/ （mg﹒g−1）	Chl/ （mg﹒g−1）	Car/ （mg﹒g−1）	花青素/ （mg﹒g−1）	黄酮（除花青素外） (mmol﹒g−1)
朱砂根	0.39 ± 0.17	0.18 ± 0.08	0.57 ± 0.25	0.07 ± 0.05	0.049	0.190
红凉伞	0.19 ± 0.08	0.11 ± 0.03	0.30 ± 0.12	0.04 ± 0.02	0.146	0.210
t值	1.768	1.56	1.705	1.163
z值					−1.993	−2.121
P值	0.152	0.194	0.163	0.31	0.046	0.034
注：花青素和黄铜指标数据为中位数。

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2.3   测序及数据组装分析

本次测序获得原始序列549625354条，过滤后得到高质量序列528890566条，且各样品高质量序列均在99.30%以上；获得高质量碱基38941295882个，占原始碱基数量（39479443800个）的98.64%；质量值Q20在97.33%～97.55%范围内，Q30为92.79%～93.40%，GC含量为45.42%～45.70%。综合来看，该测序得到的数据数量和质量都较好，可用于进一步的组装。通过Trinity软件对过滤后的高质量序列进行组装，获得84070条unigenes，总碱基数量为80300451，其中GC含量百分比为40.69%，N50数量为11407条，N50长度为1952 bp，最大长度为16884 bp，平均长度955 bp。结果表明，本次转录组测序数据组装的质量较好，可用于后续分析。对组装后的unigenes进行长度分布统计，201～300 bp的短序列最多，共24881条，占比29.60%，其次为301～400 bp的短序列，共12890条，占比15.33%。结果表明，本次转录组测序质量可靠，可用于后续分析。

2.4   Unigene功能注释分析

本次转录组测序数据经过滤组装后获得84070条unigenes，共注释44304条，其中Nr数据库注释40409条、KEGG数据库注释39034条、KOG数据库注释27949条、SwissProt数据库注释32882条，还有39766条未注释（图1a）。韦恩图（图1b）显示，4个数据库均有注释的unigenes数量为22197条。进一步用DESeq软件对朱砂根和红凉伞2个样本进行比较分析，显著DEGs筛选条件设置为FDR < 0.05且|log₂FC| > 1，共检测到1558个显著DEGs，其中610个上调，948个下调。结果表明，朱砂根与红凉伞叶片基因信息丰富，unigenes功能注释数据可用于下一步分析。

在Nr数据库注释的40409条unigenes中，同源性最高的3个物种为茶（Camellia sinensis）、中华猕猴桃（Actinidia chinensis）和圆锥小麦（Triticum turgidum）（图2）。GO数据库注释的unigenes被分到生物过程、细胞组分、分子功能三大类，unigenes数量分别为102051、69262、42248条，亚类分别为26、23、16个。其中，生物过程中unigenes数量前3的亚类是细胞过程、代谢过程和单有机体过程，分别为21489、20055、15428条；细胞组分中unigenes数量前3的亚类是细胞、细胞组件和细胞器，分别为14413、14408、10469条；分子功能中unigenes数量前3的亚类是结合因子、催化活性和转运活性，分别为18295、16094、2575条（图3）。基于KOG数据库预测，将获得注释的34004条unigenes划分为25个功能类别。其中，主要功能预测数目最多，共6869条；其次是翻译后修饰，蛋白质折叠和伴侣蛋白，共3696条；而细胞运动数目最少，仅26条。此外，还有1546条unigenes为未知功能蛋白（图5）。值得一提的是，有852条unigenes参与次生代谢物合成，转运和代谢。结果表明，朱砂根和红凉伞与茶的进化关系较近，叶片代谢旺盛，unigeness涉及的生物学过程较多，unigenes的功能分类较为全面。

图  2  Nr数据库注释物种分布统计

Figure  2.  Statistics of Nr database annotated species distribution

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图  3  GO二级分类统计

Figure  3.  GO secondary classification statistics

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2.5   KEGG功能注释分析

如图5所示，共有19339条unigenes富集在138条通路中，在Level 1层级上可划分为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和生物系统5个大类。其中，代谢类共注释11986条unigenes，分别富集在107条通路上，其中以全局和总览图通路数目最多，为4959条；遗传信息处理类共注释5172条unigenes，分别富集在21条通路上，以翻译通路数目最多，为2340条；环境信息处理类共注释665条unigenes，分别富集在4条通路上；细胞过程类和生物系统类分别注释1029、487条unigenes，且分别富集在4、2条通路上。结果表明，朱砂根和红凉伞具有旺盛的代谢活动。

图  4  KOG分类统计

Figure  4.  The KOG taxonomic term

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图  5  KEGG注释Pathway结果统计

Figure  5.  Result statistics of KEGG annotation pathway

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本研究重点关注了可能与叶色等形成密切相关的其他次生代谢产物生物合成及萜类和聚酮类化合物代谢两条通路（图6）。在Level 3层级上统计分析发现，在其他次生代谢产物生物合成通路中，共富集到苯丙素生物合成、异喹啉生物碱生物合成、类黄酮生物合成、花青素生物合成及黄酮和黄酮醇生物合成等15条通路，其中苯丙素生物合成通路中富集的unigenes数量最多（191条），其次为类黄酮生物合成通路（85条），而花青素生物合成通路及黄酮和黄酮醇生物合成通路分别仅有3条unigenes。在萜类和聚酮化合物代谢通路中，共富集到萜类骨架生物合成、类胡萝卜素生物合成和倍半萜和三萜生物合成等8条通路，其中萜类骨架生物合成通路上富集的unigenes数量最多（98条），其次为类胡萝卜素生物合成通路（55条）。以上结果表明，存在多种潜在的与叶色形成物质相关的生物合成途径。

图  6  与叶色形成相关的KEGG通路分析

a．其他次生代谢产物生物合成通路 b.类和聚酮化合物代谢通路。

Figure  6.  Analysis of the KEGG pathway related to leaf color formation

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其中，花青素生物合成通路（ko00942）的3条unigenes、黄酮和黄酮醇生物合成通路（ko00944）的3条unigenes、类黄酮生物合成通路（ko00941）的85条unigenes以及类胡萝卜素生物合成通路（ko00906）的55条unigenes与叶色形成相关。这些通路中的Unigene0018449、Unigene0022295、Unigene0001397、Unigene0006190、Unigene0007047为显著上调DEGs，Unigene0005763、Unigene0077302、Unigene0061209、Unigene0017355、Unigene0047031、Unigene0073357、Unigene0077136为显著下调DEGs（表3），推测这些基因的上调或下调表达影响了红凉伞叶色的形成。

表  3  与叶色形成相关的unigenes

Table  3.  Unigene related to leaf color formation

Unigene ID	Pathway	K_ID	基因名称	朱砂根中的表达量	红凉伞中的表达量	显著上调/下调DEGs
Unigene0001397	ko00941	K00588	At4g26220	0.07	34.21	上调
Unigene0005763	ko00906	K14595	AOG	13.84	4.68	下调
Unigene0006190	Ko00941	K13065	TAT	1.16	4.19	上调
Unigene0007047	Ko00941	K00588	CCOAOMT	0.03	2.02	上调
Unigene0017355	Ko00941	K09754	CYP98A2	4.80	0.79	下调
Unigene0018449	ko00906	K15744	Z-ISO	6.57	21.02	上调
Unigene0022295	ko00906	K09843	CYP707A2	0.53	2.58	上调
Unigene0047031	Ko00941	K00660	CHS	7.99	0.46	下调
Unigene0061209	Ko00944	K13080	C12RT1	2.03	0.28	下调
Unigene0073357	Ko00941	K00588	CCOAOMT1	29.19	2.67	下调
Unigene0077136	Ko00941	K00660	CHS2	2.24	0.11	下调
Unigene0077302	ko00906	K09843	CYP707A1	7.27	2.12	下调

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2.6   Unigene转录因子分析

本研究共1 129个基因被注释为转录因子（TF），分布在55个TF家族，其中unigenes数目大于10条的家族共计29个（图7）。排名前十的TF家族依次是ERF、bHLH、C2H2、WRKY、NAC、MYB、MYB_related、bZIP、GRAS、C3H。结果表明，2种植物叶片中的TF类型丰富，可能在其叶色形成相关代谢活动中发挥重要作用。

图  7  转录因子各家族unigenes数量

Figure  7.  Unigene number of each TF family

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2.7   SSR位点分析及引物设计与筛选

本研究对测序组装后所获得的84 070条unigenes进行SSR位点搜索，共12 682条unigenes（占比15.09%）搜索到了SSR位点，共计15 282个，包括从二核苷酸到五核苷酸的重复位点类型（图8）。其中，二核苷酸重复位点最多，占比频率为73.08%，包括AC/GT（7.66%）、AG/CT（45.83%）、AT/AT（19.59%）3种重复基序；其次为三核苷酸重复位点，占比频率为14.62%，包括AAC/GTT（0.62%）、AAG/CTT（2.53%）、AAT/ATT（3.04%）、ACC/GGT（1.06%）、AGC/CTG（1.60%）、AGG/CCT（1.69%）、ATC/ATG（1.99%）、CCG/CGG（2.09%）8种重复基序；再次为四核苷酸重复位点，占比频率为4.71%，包括AAAG/CTTT（0.56%）、AAAT/ATTT（2.25%）、ACAT/ATGT（1.90%）3种重复基序；五核苷酸重复位点占比频率仅为0.39%，含AAAAT/ATTTT一种重复基序；7.2%为其他类型重复基序。在检测到的所有重复基序中，SSR位点占比最多的3种基序依次为AC/GT（7.66%）、AG/CT（45.83%）、AT/AT（19.59%）。说明本次转录组测序所包含的SSR类型较为丰富，分布较为广泛。

图  8  不同重复类型基序 SSR 位点分布频率

Figure  8.  The frequency distribution of different repeating types for SSR loci

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本研究为进一步开发利用朱砂根及其变种的SSR，采用Primer3对检测出的SSR位点设计引物。共计9 798条unigenes成功设计出39 867对引物，扩增产物的预测大小在100～285 bp之间（表6）。同时，选择重复序列GATCT（5*5）（265 bp）、GA（2*9）（212 bp）、GCATAA（6*9）（171 bp）、ATT（3*10）（164 bp）、AGCT（4*6）（157 bp）、GGCTC（5*6）（142 bp）、AG（2*12）（117 bp）和GAA（3*7）（112 bp）的引物，在红凉伞中进行了PCR验证。如图9所示，除序列TC（2*7）外，其余引物均为可用引物。

图  9  红凉伞PCR验证

M，Marker；1（CK），对照；2，GATCT序列（265 bp）；3，GA序列（212 bp）；4，GCATAA序列（171 bp）；5，ATT序列（164 bp）；6，AGCT序列（157 bp；7，GGCTC序列（142 bp）；8，AG序列（117 bp）；9，GAA序列（112 bp）。

Figure  9.  PCR validation of A. crenata var. bicolor

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表  4  朱砂根与红凉伞叶片SSR引物序列（部分示例）

Table  4.  SSR primer sequences in leaf of A. crenata and A. crenata var. bicolor (partial examples)

重复基元与类型	上游引物（5′-3′）	下游引物（5′-3′）	产物长度
TC（2*7）	TTCAACCTCTCTCTCCTCACC	AGGTTGGGGTTGCACAGC	280
GCT（3*5）	AGATTCGGATGAAATCGTCG	CCAATTTCTCCTCCTCCTCC	278
GATCT（5*5）	TGTATCCTCCTCCTGCTGCT	CAGAAGGCAGACACCCTACC	265
TTTTTG（6*4）	CCAACCACCTGGTTTGGTAG	GGTTGGACCCATATCCCTCT	259
TTTC（4*4）	TTTGTGGAGGAGTAGGGTGG	GGACAATTTTCTCTCTCTCTCTCTC	242
TGC（3*6）	AGGCATCATCAGAGCCTTGT	TGGCTATACTAGCGCCACCT	233
ATTTT（5*4）	TATGGGGGCATTGCTCTAAG	TTGTGCACCAGCTACTCACC	229
GA（2*9）	GGGCCAGAGAAAGACAGAGA	TCGTCTCCCCTTATTTCACG	212
GGC（3*5）	TCGGACCAACACATTACCCT	TCAGTTCTTTCAACGGGGTC	207
GGAAGA（6*5）	TCCATTACGAGGCACTCCTT	CACCAACATCATGGACAAGC	196
AT（2*5）	AAGGGCCAACTAAGCTCGAT	GGGTTGTTTCGTAGTTCGGA	183
GCATAA（6*9）	CGCTATACATAGCTGTGCCG	TGCTCGTTTAGGAAGGGAGA	171
ATT（3*10）	AATATGCTGCCGACAACTCC	CCCGAGATTTGTAAGGAACG	164
AGCT（4*6）	GGGTTAAAGGGTGGTTTTGA	ATATCCGTTTTCAAGTGCCG	157
GGCTC（5*6）	GCCGAGGGTGTATAGCATGT	TTGTGTTCTGGGTGCACAAT	142
AAAGAA（6*4）	GTGCGCTCACCCTTTACCTA	TGTCGTTCTTTTCTTTTCTTTTCTT	138
AG（2*12）	AGGCTGCTGCAGAGAGAGTC	ATTCGCAATTGGCTACAAGC	127
GAA（3*7）	AAATCGAAGGATGGGGAAAG	GAATTTGACAACGGGAGTGG	112
TAAA（4*5）	CGGTTGCTATAGTGACGCAA	TTAGGTCCCGTGTGAAATCC	105
TCACC（5*5）	AAGGGTAAAGTTGGGCGTCT	AGAATCGGGACCAAAGACAA	100

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3.   结论与讨论

叶片色泽是决定观叶植物品质的重要因素之一。色差仪结合Lab颜色空间值分析，不仅拟合度更高，同时更能区分日本红枫（Acer spp.）相近颜色属性的品种，还可更直观地观察叶片的色彩变化^[25]。本研究中两种植物叶片存在显著的叶色差异（图1、表1），肉眼观察结果与色差仪测定的叶片Lab颜色空间值一致。叶片中的主要显色成分包括Chl、Car和花青素等，其中绿色叶片的主要呈色物质是叶绿素，黄色叶片的主要呈色物质是类胡萝卜素和部分类黄酮，而红色叶片的主要呈色物质为花青素^{[2, 26]}。本研究中两种植物叶片呈现叶色差异是色素含量不同引起的，实验结果从生理水平上证实了此观点，其中朱砂根叶片中的Chl a、Chl b、Chl和Car含量均高于红凉伞，而红凉伞叶片中的花青素和总黄酮（除花青素外）含量则显著高于朱砂根（p < 0.05），这为后续转录组测序分析奠定了良好的生化基础。

虽然朱砂根与红凉伞的地理分布、药用功效和观赏价值基本相同，但二者的叶色存在明显差异^[12]。通过分子生物学手段是认识和解释二者叶色过渡性状差异的有效途径。本研究对二者叶片进行转录组测序，获得了大量的生物学信息，可为后续二者叶片叶色相关活性物质合成及调控机制的研究、功能基因挖掘、遗传多样性分析及开发利用等提供理论基础。然而，功能注释中还有39766条unigene未注释，推测可能是特异性新基因、非编码RNA (ncRNA)序列、或不含蛋白质功能域短序列^[27]，也可能是因组装的unigene序列太短而缺乏保守区域，或测序过程中产生的偶然误差导致注释不完全^[28]。

研究表明，花椒(Zanthoxylum bungeanum)转色期，花青素生物合成关键基因ANS表达量升高^[29]；类黄酮化合物在植物呈色中起重要作用^[30]；黄酮类化合物可能是决定金花茶(Camellia peteloti)花色差异的主要因素^[31]；类胡萝卜素的积累可使叶片呈黄色、橙色等^[32]。与上述研究类似，本研究分析发现，朱砂根和红凉伞叶色形成与KEGG中的这4条通路（图9）密切相关，其中黄酮和黄酮醇生物合成通路的C12RT1，类黄酮生物合成通路的CYP98A2、CHS、CCOAOMT1、CHS2及类胡萝卜素生物合成通路的AOG、CYP707A1表达量均显著下调，而类黄酮生物合成通路的At4g26220、TAT、CCOAOMT及类胡萝卜素生物合成通路的Z-ISO、CYP707A2表达量均显著上调（表5）。推测这些基因的上调或下调表达影响着红凉伞叶色的形成，这些基因的获得，可为深入研究朱砂根及红凉伞叶色提供基因资源，有利于从分子水平对叶色形成的多种代谢及信息加工途径进行分析，但各基因的具体功能还有待进一步验证。

转录因子在转录水平上调控基因表达，广泛参与植物生长发育、器官形态建成、逆境胁迫和激素信号应答等^[33]。研究表明，ERF转录因子主要通过调控下游生长发育调节基因（如GRF5）来调控杨树（Populus tremula）的叶片形态建成^[34]；bHLH是杂交兰（Hybrid Cymbidium）叶色相关的转录因子之一^[33]；NAC和MYB是杂交兰叶色相关的转录因子^[33]；MYB-related转录因子RADIALIS-LIKE3（OsRL3）可促进水稻（Oryza sativa）深绿色叶片诱导^[35]；转录因子WRKY32通过与乙烯信号转导的重要组分YFT1基因的启动子调控区W-box和W-box-like基序结合，可调控番茄（Solanum lycopersicum）果实颜色的形成^[36]；bZIP转录因子HY5可介导番茄中CRY1a诱导的花青素生物合成^[37]；C2H2锌指转录因子OBV可正向调节番茄叶脉中叶绿体发育和束鞘延伸^[38]；转录因子MYB（VvMYBA1和VvMYBA2）、bHLH、GRAS、NAC和bZIP可能对葡萄（Vitis vinifera）果实中花色苷积累具有重要的调控作用^[39]；C3H转录因子是细胞色素P450中的一员，与木质素生物合成途径密切相关^[40]。上述转录因子在本研究结果中数量居前十，其中ERF和bHLH家族最多（图10），推测这些转录因子可能参与叶色形成相关代谢物质的生物合成及基因调控，但具体的生物学功能还有待进一步研究。

此外，本研究搜索出了15282个SSR位点，与伊丽莎白安格斯三角梅（Bougainvillea glabra 'Elizabeth Angus'）^[41]等植物叶片转录组分析结果类似，即SSR位点类型较为丰富且分布较为广泛，具有一定的分子标记开发价值和潜能。同时，对所有的SSR位点成功设计出39867对引物（表2），并进行了部分验证（图11），为进一步开展连锁图谱构建、遗传多样性分析、分子鉴别、分子辅助育种以及谱系分析等，积累基础并提供分子手段。同时为深入挖掘叶色相关功能基因、分子标记辅助育种和遗传多样性研究等提供理论基础，然而具体的研究机制还需进一步探索。